蛋白質純化方法經典攻略（二）

那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白質純化方法經典攻略（二）：
初始樣品制備
無論目標蛋白的來源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的制備很重要。同時也需要考慮表達和純化策略。
目標蛋白的胞外分泌可使用簡單快速親和純化方案；所需的唯*一樣品制備可能需要傾倒貼壁細胞的條件培養基或者低速離心以去除懸浮細胞。當然，制備過程的**步色譜層析時可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調節pH，但這些步驟簡單易行。然而，如果**步純化樣品步驟進行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽。當處理大量條件培養基時可能會有技術難度；根據培養基的脫鹽體積?？刹捎猛肝龌蝈e流過濾。
如果靶蛋白在胞內表達，則細胞首先需要通過離心獲取，然后用合適的裂解緩沖液重懸。如上所述，裂解緩沖液需要包含合適的緩沖液和其它添加劑以確保靶蛋白的*大穩定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時的緩沖液交換步驟，則樣品/裂解緩沖液的組成也需與隨后的純化步驟相適宜。
接下來，需要有效的細胞裂解方法。大腸桿菌可以通過弗氏壓碎器裂解（盡管這種方法不容易規?；?，超聲或基于洗滌劑的裂解（有很多商業裂解試劑）。通過向裂解緩沖液中加入溶菌酶可以改善基于洗滌劑的裂解效率?；谙礈靹┑牧呀夥浅睾?，且不導致細*菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產生具有良好流動特性的樣品，通常需要加入含DNA酶（高純度制劑可商購）。
哺乳動物和昆蟲細胞也可以通過超聲或基于洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要DNA酶處理降低樣品粘度。
一旦細胞（微生物/昆蟲/哺乳動物）被裂解，通常需要離心除去細胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，以避免色譜柱堵塞）。所得上清液即可開始用于靶蛋白的柱色譜層析純化。 柱層析的基本原理是將一份蛋白質混合物分成很多小份，從而使某些組分中目標蛋白的濃度通過濃縮得以增大。雖然已經有很多昂貴和特殊的設備可用于柱層析，但實際上它只需要*基本的設備即可。
基本柱層析設備1、固定相：一種惰性介質, 通常帶有一種可促進蛋白質相互作用的官能團以進行蛋白質分離。固定相和官能團的選擇取決于層析色譜和方法的種類。
2、柱子：一種圓柱形玻璃容器，長度和直徑各不相同。柱子可以直接購買已填裝固定相能直接連接到層析設備上使用的預裝柱，或可購買空柱自己手動填裝。自動層析設備和人工重力柱使用的是不種類型的柱子。
3、溶劑：含有添加劑的緩沖液，作為將蛋白質在固定相上平衡和洗脫的流動相。不同類型的柱層析需要不同的溶液條件。
4、收集管：用于收集洗脫液樣品的容器。自動組分收集器需要特定的收集管。手動收集時，則試管或容器均可使用。
5、純度檢測方法：一種檢測樣品里所有蛋白質中目標蛋白相對含量的檢測手段。每一步獲得的含有目標蛋白的組分都必須在進行下一步純化工作前進行檢測。后面的章節將對一些常用的純度分析方法進行討論。 柱層析可以依賴用泵將溶劑以固定流速打入填裝好的層析柱的自動設備來完成或者依靠流動相的重力作用自己完成。自動系統或者重力柱系統均可與自動組分收集器連接使用。

系統類型	優點	缺點
自動	設備自動運行 常連接一臺吸光度檢測器 可程序設定平衡和洗脫步驟 可輕松設定梯度洗脫 重復性好	需要配套特定、昂貴的設備 *大流速受層析柱壓力限限制
重力流	便宜 操作者可控性更強 運行過程中可隨時調節	更依賴人工 流速受重力作用限制

表三：蛋白質分離柱層析系統

親和層析

親和層析主要依靠蛋白質與介質配體間特異性的可逆結合作用進行分離。配體可直接與目標蛋白質結合，也可以與蛋白質共價結合的標簽結合。親和層析通常是一種*粗放的純化過程，一般在純化工藝的前期應用?；诤罄m應用的要求，可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質。
親和層析的固定相是一種共價結合特異性配體的惰性介質，該配體可與一個蛋白質或一類蛋白質特異性結合。惰性介質通常是交聯的瓊脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白質可采用選擇性或非選擇性模式來進行親和柱層析純化。在選擇性親和柱層析中，一般使用對蛋白質有特異性作用的配體或共價結合的標簽。在非選擇性親和柱層析中，如用于免*疫球蛋白純化的蛋白A、G、L，用于DNA結合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，這些配體與一類蛋白都具有相似的結合能力。

圖 4. 用蛋白A、G、L進行親和層析的原理示意圖：A.抗體含有多個功能區：一類蛋白質的Fc區（片段，恒定區） 都是相同的，Fv區（片段，可變區）是每個抗體各不相同的特異區，Fab（片段，抗原區）是抗體實際與特異性抗原結合的區域。B.抗體的特異性區域可以通過親和色譜進行非選擇性純化，在該過程中，配體 （蛋白 A、G、L）是結合在分離介質上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于純化特異性蛋白。這種情況下，抗體作為中間配體為其抗原提供選擇性。
兩類親和色譜中，在不影響蛋白質（或標簽） 和配體間作用力的條件下，蛋白質均在柱上保留。在不破壞特異性相互作用但可破壞所有雜蛋白與固定相間其非特異性作用的條件下，對所有結合的蛋白質進行淋洗。*后用含有競爭分子的緩沖液或者可破壞所有蛋白質間相互作用的條件對結合蛋白進行洗脫。
競爭分子可代替目標蛋白與配體相結合。這種競爭分子可通過其他層析手段或者透析的方式從目標蛋白中去除。通過破壞所有蛋白間相互作用來從固定相洗脫蛋白的方法包括調節緩沖液的pH值或者離子強度。因為這些方法同樣會影響蛋白質的穩定性，因此通常建議洗脫下來的蛋白質要立即中和或者稀釋以將危害降到*小。有報道稱，對于不同形式的親和層析，為獲得*高產率的活性蛋白需采用多種不同的流動相條件  。
 

目標蛋白	配體伴隨	洗脫
抗體（抗原特異性）	抗原多肽	自由肽
多組氨酸標記蛋白	Ni2+ or Co2+	咪唑或游離組氨酸
FLAG標記蛋白質	FLAG特異性抗體	FLAG多肽或低pH值
GST標記蛋白質	還原型谷胱甘肽	游離谷胱甘肽
Myc標記蛋白質	Myc特異性抗體	低pH值
抗體（類型特異性）	蛋白A , G, or L	極端pH值
DNA結合蛋白質	肝素	高離子強度

表五：帶有特異性活性官能團（配體）的選擇性和非選擇性親和層析示例及其典型洗脫條件。

總結自Thermo Fisher Pierce和GE。不同類型層析柱的供應商見下，由來邦網（Labome）基于200余篇文獻調研給出。
設計蛋白質表達質粒時，即可在其N端或C端（或在少數情況下，在結構已知蛋白質的柔性環狀區域） 引入親和標簽以助于純化。
抗體通常是基于抗體與其抗原 （抗體識別的序列） 間的高特異性相互作用來進行純化。一個含有抗原的多肽可以與帶有抗體特異結合位點的介質相結合。降低流動相緩沖液的pH值可破壞抗體/多肽間相互作用力，釋放出結合抗體。商業上，該方法常用于血清原液中抗體的純化。
蛋白質同樣可通過非選擇性方式進行親和純化。在非選擇性純化過程中，固定相上結合的配體可以與一類具有類似結合部位的蛋白質相結合。DNA結合蛋白質的純化就是一個非選擇性親和層析的實例。因為肝素與DNA的結構和電荷極為類似，它可以被作為DNA結合蛋白質親和層析的配體。
由于所有的DNA結合蛋白質理論上都可以與該固定相結合，幾乎其他所有蛋白質都會穿透而不與介質結合，從而可達到目標蛋白產率*大程度的富集。另一個例子是抗體通過其恒定區 （Fc）與配體間的相互作用進行富集濃縮，蛋白A、G、L都是常用的配體。GE Healthcare的蛋白A親和層析柱 [15-17] 和蛋白G [18] 都是常用的選擇。
當采用類似的結合模式（抗體與蛋白A、 G或 L配體結合）時，抗體的抗原結合區（Fab）仍然保持與其特異性抗原結合的能力。因此，特異性蛋白可通過配體/抗體結合和抗體的抗原間的特異性相互作用來純化。

常見問題及解決方式見表6。

問題	原因	解決方法
蛋白不結合	標簽未翻譯或不可及	檢查質粒序列或將標簽移到其他位置
	結合條件不合適	調節緩沖液條件
	結合時間不夠	降低流速或停止過柱以延長結合時間
蛋白未洗脫出	配體與標簽間相互作用過強	增大（特異性） 競爭分子濃度或調節條件更嚴格（非特異性）
	蛋白質柱上聚集	調整緩沖液到更利于保持蛋白質穩定性的條件
低分辨率	流速過慢或過快	調整流速
	柱子未充分洗脫	用條件更嚴格的緩沖液淋洗；根據廠家指導清洗固定相
	蛋白質柱上聚集	調整緩沖液到更利于保持蛋白質穩定性的條件
	洗脫條件不夠嚴格	增大（特異性） 競爭分子濃度，或調節條件（非特異性）
純化過程中蛋白質失活	蛋白質去折疊或聚集	調整緩沖液到更利于保持蛋白質穩定性的條件
	保持活性必要的輔因子在純化過程中被除去	添加輔因子

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