蛋白質純化方法經典攻略（一）

那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白質純化方法經典攻略（一）： 建立蛋白質純化工藝時，*重要的是需要考慮純化得到的蛋白質應能滿足其后續應用要求。蛋白質的數量及純度都必須滿足實驗分析要求。而且，因為后續研究需要的是保持良好折疊結構的活性蛋白質，因此蛋白質行為的相關信息也需要考慮。在純化及后續的保存過程中，很多處理方法都會對蛋白質的性質產生影響，如蛋白質的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細計劃，在*短時間內完成蛋白質純化，并在*穩定的條件下進行保存才算是成功地完成了其整個純化過程。 每一步純化過程中，蛋白質的溶液環境對其穩定性和活性的保持都非常關鍵。蛋白質應該保存在一個良好的緩沖液環境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對蛋白質折疊狀態、溶解性和活性造成不可逆的影響。
緩沖液是一種含有共軛酸/堿對的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結構，50%為堿式結構時的pH值 （圖1）。

Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當pH=8.06，50%的Tris是質子化（酸式結構），50%是去質子化（堿式結構）。
關于緩沖液的一個常規原則是，其pH值應保證在pKa值左右1個pH值單位范圍內，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時有足夠的以酸式結構和堿式結構存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導致的蛋白質穩定性改變。 很多物質都可以用于生物緩沖液。*常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種*常用的生物緩沖液、各自的pH值應用范圍及各自可能對蛋白質純化過程產生影響的優缺點。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。

緩沖液	pH范圍	優缺點
磷酸緩沖液	5.8-8.0	pH值不隨溫度變化 便宜 紫外無吸收 不能與二價陽離子一起使用
MOPS緩沖液	6.5-7.9	不能高壓滅*菌處理 pH值一定程度上隨溫度變化 在生理pH值范圍內具有高緩沖能力
HEPES緩沖液	6.8-8.2	不能高壓滅*菌處理 pH一定程度上隨溫度變化 一定條件下會生成自由基
Tris緩沖液	7.5-9.0	pH值在一定程度上隨溫度或稀釋程度變化 便宜 會對部分酶活性造成影響  紫外無吸收

表一：蛋白質純化中*常用的生物緩沖液

緩沖液在一定pH值范圍內可保持它們的緩沖能力，部分緩沖液成分會對某些層析過程或者分析實驗造成影響。
 

溶液添加劑

除了一個合適的緩沖液體系，蛋白質純化過程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對蛋白質純度、穩定性和活性方面均具有一定作用的成分。
溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會添加蛋白酶抑制劑以防止目標蛋白質被內源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因為此時幾乎所有的蛋白酶都已經從目標蛋白質分離出去。蛋白質的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結合以防止目標蛋白質被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護蛋白質不被破壞和增強其溶解性。

 

類型	功能	常用試劑
還原劑	防止氧化	2-mercaptoethanol （BME） Dithiothreiotol （DTT） Tris （2-carboxyethyl） phosphine （TCEP）
蛋白酶抑制劑	防止內源性蛋白酶分解蛋白	亮抑肽酶 （絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑） 抑胃肽 （天冬氨酸蛋白酶抑制劑） PMSF （絲氨酸蛋白酶抑制劑）
金屬螯合劑	使金屬蛋白酶失活	EDTA EGTA
精氨酸激酶	穩定蛋白質結構，增強溶解性	丙三醇 去污劑（如CHAPS，NP-40，Triton X-100） 糖（如葡萄糖、蔗糖等）
離子穩定劑	增強溶解性	鹽類 （如NaCl、KCl、（NH4）2SO4

表二：蛋白質純化中用于增強蛋白質穩定性的常用添加劑。

添加劑只在必要時才使用?？赡苄枰啻螄L試才能確定某些添加劑是否對一些特定蛋白質的純化工藝有效。

  蛋白質純化工藝中的其他因素也會對蛋白質的穩定性產生影響。對蛋白質的處理步驟越少越好，在*短時間內采用*少步驟的純化工藝才能保證得到*高產率的活性蛋白質。而且，在整個純化過程中，蛋白質*好都保持在低溫狀態。一般純化過程都在4°C進行,因為這個溫度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情況下），又可以保證蛋白質的結構完整性。 開始純化蛋白前應先制備初始樣品。真正進行蛋白純化的操作之前，首要考慮是目的蛋白的來源。樣品來源可為原始樣品，例如肝臟，肌肉或腦組織。雖然后基因組學領域的研究者很少使用原始組織純化蛋白，但當研究者想要關聯某一蛋白序列的催化活性時，會有這樣的需求。
當前，更為常見的是從重組來源的樣品純化蛋白質。一些重要決定需要提前考慮以便優化后續的純化。研究者需要考慮蛋白質的*終用途（例如酶測定，結構研究，抗體生成），因為這將決定*終蛋白質制備所需的量和純度。盡管蛋白質表達的詳細討論超出本文范圍，但是在這一點上仍有幾個值得考慮的基本點，因為它們直接影響后續的蛋白純化。
哪個系統的表達水平*高？一般規則是，表達水平越高，越容易獲得大量高度純化蛋白。如果選擇大腸桿菌表達系統，*終目的可溶性表達或不可溶表達是包涵體形式嗎？由于包涵體中有高豐度的重組蛋白，包涵體的分離本身構成了純化的重要步驟; 這必須與溶解難易和隨后包涵體中再折疊靶蛋白的難易以及可溶性蛋白的*終產量相平衡。已經有許多工作優化了從包涵體中產生功能蛋白的產量。
另一個考慮是是否靶向胞內或胞外（分泌的）表達。胞內表達需要將蛋白質從大量宿主細胞蛋白中純化而來。相比之下，特別是當宿主細胞在無血清條件下生長時，目標蛋白的有效分泌要求蛋白必須從少量分泌的宿主蛋白中純化而來。

        以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結蛋白質純化方法經典攻略（一）。
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