蛋白純化方法，看看有你不會的嗎？

那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白純化方法，看看有你不會的嗎？
蛋白質在組織或細胞中一般都是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千中不同的蛋白質。蛋白質的分離和提純工作是一項艱巨而繁重的任務,到目前為止,還沒有一個單獨的或一套現成的方法能把任何一種蛋白質從復雜的混合物中提取出來,但對任何一種蛋白質都有可能選擇一套適當的分離提純程序來獲得高純度的制品。
蛋白質提純的總目標是設法增加制品純度或比活性,對純化的要求以合理的效率、速度、收率和純度,將需要蛋白質從細胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來,同時仍保留有這種多肽的生物學活性和化學完整性。

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟:

1、材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中稀釋出來并保持原來的天然狀態,不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:

(1)機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

(2)滲透破碎法這種方法是在低滲條件下使細胞溶脹而破碎。

(3)反復凍融法生物組織經凍結后,細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。

(4)超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

(5)酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

2、蛋白質的抽提通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、triton X-100等),使膜結構破壞,利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質的變性。

3、蛋白質粗制品的獲得選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法。

(1)等電點沉淀法不同蛋白質的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離。

(2)鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質,并能再度溶解而不變性。

(3)有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質。此外,有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層,促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性,使用該法時,要注意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度。

4、樣品的進一步分離純化用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質,須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。

有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

5、紫外吸收法測蛋白質含量蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。利用一定波長下,蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系,可以進行蛋白質含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速、不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測,因為此時只需測定蛋白質濃度的變化,而不需知道其優良值。

此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差,干擾物質多,在用標準曲線測定蛋白質含量時,對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質,有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質,會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進行計算的方法,加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經過校正,測定的結果還是存在一定的誤差。

此外,進行紫外吸收法測定時,由于蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。

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