蛋白純化常見問題（二）

那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡單介紹一下蛋白純化常見問題（二）。
Q：Superdex 75( 球蛋白分離范圍 3 – 70 KDA)， Superdex 200 (10 – 600 KDA) 和 Superose 6(5-5000 KDA)，分離范圍有重疊，如何選擇？
A：一般使待分離樣品的分子量位于線性分離范圍中部。根據分子量 Marker 在三種柱子上的表現，三者常規推薦 ：蛋白分子量在 40 kDa 以下 (3 kDa 以上 ) 考慮使用 Superdex 75；40 – 400 kDa的樣品考慮使用 Superdex 200；分離 400 kDa 以上樣品時，建議選擇 Superose 6 Increase。

Q：脫鹽實驗中的緩沖液如何選擇？
A：如果我們用緩沖液 A 來平衡柱子，上樣后，走外水的樣品其實是跟著平衡時的緩沖液 A 出峰并溶解在其中的（而非*后趕樣品用的洗脫緩沖液）。因此，希望樣品溶解在緩沖液 A 中，就用緩沖液 A 來平衡柱子。緩沖液的選擇，依據實驗需求和填料本身耐受性，同時確保樣品在該緩沖液中穩定存在。通常，使用 10-50 mM 磷酸鈉緩沖液，至少含有 25 mM NaCl 用于避免離子作用的非特異性吸附，中性 pH 7.0 ~ 7.4?；驌]發性緩沖液如 100 mM 乙酸銨或碳酸氫銨。

Q：純化得到的組分中沒有或很少目的 His 標簽蛋白，怎么回事？
A：若目的 His 標簽蛋白正常表達（使用抗 His 標簽的抗體進行 WB 檢測）且充分釋放至上清中，確認蛋白是流穿還是未被洗脫：
若 His 標簽蛋白流穿 ：
樣品或結合緩沖液的條件不合適，注意螯合劑或強還原劑以及咪唑的濃度。
His 標簽蛋白與填料的結合較弱：降低上樣流速或增加孵育時間 ；增加標簽 His 的數量（常用 6 – 10 個）。
His 標簽未充分暴露：在變性條件（4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 鹽酸胍） 下進行純化或測試；重新構建克隆，改變 His 標簽的位置。
嘗試其他的金屬離子：如 鋅離子，鈷離子等。
若 His 標簽蛋白未洗脫：
洗脫條件過于溫和：增加咪唑濃度或降低洗脫 pH（注意：pH降至 4.0 以下時 Ni2+ 會發生脫落）。
目的蛋白與填料發生非特異性疏水或其他相互作用：在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（如 2% Triton X-100）或提高 NaCl濃度。
目的蛋白在填料中發生了沉淀：減少上樣量；使用咪唑線性梯度而不是步級洗脫以降低洗脫得到的蛋白濃度；使用去垢劑或改變 NaCl 濃度；在變性條件 (4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 鹽酸胍 )下洗脫。


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